Острые миелоидные лейкозы

Комментарий: пункционное исследование (аспирация) костного мозга является обязательной рутинной диагностической процедурой. Мазки костного мозга исследуют с помощью окраски по Маю–Грюнвальду, Паппенгейму или Райту–Гимзе. Выполнение трепанобиопсии не является обязательным, за исключением ситуаций с так называемым «сухим проколом» или очень скудным пунктатом костного мозга. Рекомендовано исследовать как минимум 500 ядросодержащих клеток в мазке костного мозга.

Для установления диагноза ОМЛ в мазке периферической крови или костного мозга необходимо наличие 20% бластных клеток и более. При ОМЛ с t(15;17), t(8;21), inv(16) или t(16;16) доля бластных клеток может быть менее 20%. В соответствии с актуальной классификацией ВОЗ (2016) процент бластных клеток подсчитывают вне зависимости от доли красного ростка.

Миелобласты, монобласты и мегакариобласты включают в общее число бластных клеток. В случаях ОМЛ с моноцитарной и миеломоноцитарной дифференцировкой промоноциты (но не атипические/зрелые моноциты) также считают эквивалентами бластных клеток. Эритробласты не включают в общее число бластных клеток.

При оценке степени выраженности дисплазии за мультилинейную дисплазию считают наличие признаков дисплазии в 50% и более клеток в 2-х или 3-х ростках кроветворения. При этом необходимо оценить не менее 25 эритрокариоцитов, 25 гранулоцитов и 6 мегакариоцитов.

Для верификации диагноза истинного эритроидного лейкоза при подсчете пунктата костного мозга клетки эритроидного ряда должны составлять >80% от всех клеток костного мозга, при этом проэритробласты должны быть ≥30%, без учета миелобластов. В соответствии с номенклатурой ВОЗ проэритробласты – незрелые эритрокариоциты, при этом, в соответствии с терминологией клеток эритропоэза по И.А. Кассирскому и Г.А. Алексееву, – это эритробласты и пронормобласты. При истинном эритробластном лейкозе дисмегакароцитопоэз встречается часто, в то время как дисгранулоцитопоэз – редко. При разведении пунктата костного мозга периферической кровью и количестве клеток красного ряда менее 80% его оценка может проводиться по трепанобиоптату [33].

Выполнение цитохимического анализа клеток костного мозга необходимо, даже если определяется высокое содержание бластных клеток в периферической крови. Это связано с тем, что в ряде случаев цитохимические реакции могут давать различные результаты в клетках периферической крови и костного мозга, что может повлечь за собой установление ошибочного диагноза. Диагноз основывают на результатах исследования, полученного на клетках костного мозга. Используют реакции на миелопероксидазу (МПО) или судановый черный, неспецифическую эстеразу (альфа-нафтилацетатэстеразу, подавляемую или нет фторидом натрия) и ШИК (шифф-йодную кислоту) или PAS (Periodic Acid Schiff). Обнаружение МПО в 3% бластных клеток и более указывает на миелоидную линию дифференцировки. В то же время ее отсутствие не исключает миелоидную направленность клеток, потому что в ранних миелобластах и монобластах, а также мегакариобластах и эритробластах МПО <3% или не определяется. Окраска судановым черным аналогична МПО, но является менее специфичной. Ее проводят только в тех случаях, когда невозможно выполнить реакцию на миелопероксидазу. Неспецифическая эстераза имеет высокую диффузную или гранулярную цитоплазматическую активность (в зависимости от методики проведения реакции) в монобластах и промоноцитах, которая должна подавляться полностью или значительно фторидом натрия. ШИК-реакция в миелобластах определяется в диффузном виде, в монобластах и промоноцитах – в диффузно-гранулярном, в эритробластах – в виде гранул или блоков. На основании морфоцитохимического исследования бластных клеток может быть диагностировано около 90% случаев ОМЛ, при отсутствии активности МПО и неспецифической эстеразы необходимо проведение иммунофенотипического (ИФТ) исследования методом проточной цитофлуориметрии.

Комментарий: ИФТ-исследование выполняется всегда на клетках костного мозга, даже если определяется высокое содержание бластных клеток в периферической крови. Определение процента бластных клеток методом проточной цитофлуориметрии при первичной диагностике не является заменой морфологического подсчета, так как результаты этих двух исследований могут не совпадать [34].

Для подтверждения миелоидной направленности опухолевых клеток необходимо оценить экспрессию миелоидных антигенов. MPO – линейно-специфический маркер миелоидной линии, лизосомальный фермент гранулоцитов. К менее специфичным миелоидассоциированным антигенам относятся CD11b, CD11c, CD13, CD15, CD16, CD33, CD64, CD65, CD66b, лизоцим и др. Диагноз ОМЛ может быть установлен и в том случае, если MPO не выявляется, а опухолевые клетки экспрессируют другие, менее специфичные миелоидные маркеры, и исключен лимфобластный вариант ОЛ.

Между морфоцитохимической классификацией французско-американско-британской (FAB) и ИФТ-признаками нет четкой корреляции. Большинство миелоидных маркеров могут быть как положительными, так и отрицательными при разных вариантах ОМЛ по FAB-классификации, за исключением специфических антигенов CD41а и CD61, которые характерны только для мегакариоцитарной/тромбоцитарной линии. Даже гликофорин А (CD235a), маркер эритроидной линии, может быть отрицательным при эритробластном лейкозе, если опухолевые клетки происходят из более ранних предшественников. Таким образом, по данным ИФТ-исследования нельзя определять FAB-вариант ОМЛ.

Бластные клетки считаются положительными по экспрессии мембранного антигена, если он определяется на 20% бластных клеток и более (пороговое значение). Для цитоплазматических маркеров (таких как цитоплазматический CD3, MPO, лизоцим, ядерная TdT и др.) используют более низкий порог – 10%.

В случае невозможности получения аспирата костного мозга выполнют иммуногистохимическое исследование трепанобиоптата костного мозга.

ИФТ-исследование проводят с помощью мультипараметрической проточной цитофлуориметрии (обычно как минимум 6-цветной). В случае анализа трепанобиоптата выполняется его иммуногистохимическое исследование. Особенно ИФТ-исследование необходимо для установления диагноза ОМЛ с минимальной дифференцировкой, острого мегакариоцитарного лейкоза и ОЛ с неопределенной дифференцировкой. ОЛ неясной линейности являются редкими типами лейкозов и включают случаи, которые не имеют признаков принадлежности к какой-либо клеточной линии (острый недифференцированный лейкоз) или такие случаи, бластные клетки которых экспрессируют маркеры более чем одной линии дифференцировки. В классификации Европейской группы по иммунологическому описанию лейкозов (EGIL) ОЛСФ подразделяют на острый бифенотипический лейкоз, когда одна опухолевая популяция экспрессирует антигены нескольких линий дифференцировки, и острый билинейный лейкоз, при котором существуют 2 и более популяции бластных клеток разной линейности. В классификации ВОЗ эти варианты объединены в ОЛСФ.

Комментарий: Перечисленные исследования выполняются на аспирате костного мозга для стратификации пациентов по группам риска и определения тактики лечения, а также в целях выявления маркера для мониторинга динамики опухолевого клона на фоне терапии. В случае невозможности забора образца костного мозга допускается определение мутаций в генах на материале периферической крови пациента.

Молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене FLT3 является обязательным, поскольку современные подходы к лечению ОМЛ предусматривают использование ингибиторов протеинкиназы у больных с FLT3-позитивным вариантом заболевания. ОМЛ с мутациями в генах NPM1 или CEBPA определены ВОЗ как отдельные категории. Мутация NPM1 является маркером для оценки МОБ. Экспрессия генов ERG, MN1, EVI1, BAALC, мутации генов WT1, KIT, RAS, TET2, DNMT3A, IDH1, IDH2В могут быть изучены в рамках клинических исследований и в редких случаях при констатации рефрактерности или рецидива с целью поиска новых терапевтических подходов. В современной молекулярной диагностике ОМЛ широко применяется и метод секвенирования нового поколения, созданы так называемые диагностические панели из нескольких десятков генов, вовлеченных в патогенез ОМЛ, которые позволяют четко отнести исследуемый ОМЛ к той или иной категории риска

Комментарий: для подтверждения полноты достигнутого ответа на терапию и его сохранение, в соответствии с современными международными рекомендациями, необходимо выполнять в контрольные точки оценку МОБ методом проточной цитофлуорометрии (аберрантный иммунофенотип), а для CBF-ОМЛ – только молекулярное исследование МОБ методом ПЦР (количественная оценка экспрессии RUNX1::RUNX1T1, CBFB::MYH1, мутации NPM1). МОБ методом проточной цитофлуориметрии должна быть оценена в специализированной лаборатории (не менее чем на 8-цветном цитометре) с использованием всех необходимых моноклональных антител для достижения высокой чувствительности и специфичности с сочетанием двух подходов: 1. определение лейкоз-ассоциированного иммунофенотипа в период диагностики заболевания; 2. метод «пустых мест», заключающийся в поиске клеток, отличных от нормальных прототипов [35, 36].

Определение МОБ-статуса в процессе лечения может изменить прогноз больного и во время определить целесообразность выполнения пациентам алло-ТГСК [37].

Комментарий: микроскопическое исследование спинномозговой жидкости необходимо выполнять всем пациентам при цитозе ≥5/мкл. Рекомендуется с целью повышения точности анализа использовать для приготовления цитологических препаратов спинномозговой жидкости цитологическую центрифугу.

При ОМЛ, в целом, вовлечение центральной нервной системы встречается менее чем у 5% пациентов, однако при ряде вариантов ОМЛ, особенно с моноцитарной дифференцировкой, вероятность вовлечения в процесс оболочек головного мозга выше.

Желательно поддерживать число тромбоцитов перед выполнением спинномозговой пункции 30´10⁹/л и выше. Если уровень тромбоцитов не удается повысить до 30*10⁹/л и выше, при отсутствии клинических признаков поражения центральной нервной системы от пункции можно воздержаться до повышения тромбоцитов в гемограмме выше 30*10⁹/л.

Если у пациента определяется лейкоцитоз выше 100*10⁹/л, первую спинномозговую пункцию следует отложить до редукции числа лейкоцитов менее 30–40*0⁹/л.

Нейролейкемию диагностируют при обнаружении в спинномозговой жидкости, полученной при первой диагностической спинномозговой пункции, любого количества бластных клеток при любом цитозе или цитоза 15/3 и более (т.е. более 5 клеток в 1 мкл).