3. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГИПЕРКОАГУЛЯЦИОННЫХ НАРУШЕНИЙ

Гемостаз - это сложный процесс, включающий адгезию тромбоцитов к поврежденному эндотелию, образование тромбоцитарной пробки (агрегации), формирование фибриновой сети для стабилизации пробки, ретракцию сгустка и, наконец, фибринолиз. На протяжении многих десятилетий разрабатывались различные тесты и устройства для оценки свертываемости крови и функции тромбоцитов in vitro. Хотя эти тесты предоставляют полезную информацию о состоянии свертывания или функции тромбоцитов, они ограничены с точки зрения их способности прогнозировать тромботический риск в клинических условиях, отчасти потому, что они не включают в себя многие из ключевых факторов контроля гемостаза, которые существуют in vivo.

Изменение представлений о стадиях гемостаза и тромбоза, а также о роли отдельных реакций в этих процессах, неминуемо влечет за собой необходимость радикального пересмотра диагностических и терапевтических методов, которые используют в клинической практике. В настоящий момент создаются и испытываются новые варианты классических тестов гемостаза, а также ряд полностью оригинальных подходов. Это открывает дорогу для создания новых лекарственных препаратов и методов диагностики для тромбоцитарного и плазменного звеньев гемостаза в клинике.

Важной особенностью тромбоцита является способность к активации – быстрому и необратимому переходу в новое состояние. Стимулом активации может служить любое возмущение окружающей среды, вплоть до простого механического напряжения. В нормальном состоянии мембрана тромбоцита не поддерживает реакций свертывания, отрицательно заряженные фосфолипиды сосредоточены на внутреннем слое мембраны, а фосфатидилхолин внешнего слоя связывает факторы крови гораздо хуже, не смотря на то, что некоторые из них могут связываться и с неактивированными тромбоцитами, но это не приводит к формированию активных ферментативных комплексов.

Активация тромбоцитов – важный этап нормального гемостаза, при котором тромбоциты проявляют способность к адгезии и агрегации, что лежит в основе формирования тромбоцитарной пробки в месте повреждения. Кроме того, при активации имеет место экспозиция и/или конформационное изменение многих трансмембранных белков внешнего слоя мембраны, и они приобретают способность специфически связывать факторы свертывания, ускоряя реакции с их участием.

Тромбоциты играют значимую роль в развитии атеросклероза, облегчая миграцию лейкоцитов, таким образом, способствуя началу и прогрессированию роста атеросклеротической бляшки и отрицательно влияя на ее стабильность.

К показателям, характеризующим тромбоцитарный компонент гемостаза относятся:

• спонтанная агрегация тромбоцитов,
• агрегация тромбоцитов с АДФ,
• агрегация тромбоцитов с коллагеном,
• агрегации тромбоцитов с адреналином.

При анализе агрегатограмм обращают внимание на общий характер агрегации (одноволновая, двухволновая; полная, неполная; обратимая, необратимая), разницу между оптической плотностью плазмы до начала агрегации и после достижения максимальной агрегации (характеризует интенсивность агрегации), а также уменьшение оптической плотности плазмы за первую минуту агрегации или угол наклона кривой на этапе бурной агрегации (характеризует скорость агрегации). Важно отметить, что появление двухволновой агрегации при стимуляции АДФ и адреналином в концентрациях, вызывающих в норме обратимую агрегацию (обычно 1−5 мкмоль), указывает на повышение чувствительности тромбоцитов к этим индукторам, а развитие одноволновой неполной (а часто и обратимой) агрегации при стимуляции ими в концентрациях 10 мкмоль и больше — на нарушение реакции высвобождения тромбоцитов.

Агрегация тромбоцитов с АДФ. После добавления агреганта на кривой появляются осцилляции за счёт изменения формы тромбоцитов. Тромбоциты соединяются в агрегаты и кривая отклоняется вверх (первичная волна). Когда подъём переходит в «плато», то происходит реакция высвобождения, и кривая ещё больше поднимается вверх (вторичная волна).

При воздействии малых доз АДФ на агрегатограмме регистрируют двойную волну агрегации. Первая фаза (первичная волна) зависит от добавленного экзогенного АДФ, а вторая фаза (вторичная волна агрегации) — от реакции высвобождения собственных агонистов, содержащихся в гранулах тромбоцитов.

Агрегация тромбоцитов с коллагеном. Коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов имеет достаточно выраженную латентную фазу, во время которой происходит активация фосфолипазы. В зависимости от используемого реагента продолжительность этой фазы может составлять 5−7 мин. После завершения этого периода в тромбоцитах происходят процессы, приводящие к образованию вторичных посредников, вследствие чего развивается секреция тромбоцитарных гранул и синтез тромбоксана А2, что сопровождается резким усилением межтромбоцитарного взаимодействия.

Для диагностики риска тромботических осложнений используют следующие параметры оценки системы свертывания крови:

Фибриноген. Повышение уровня фибриногена в плазме крови ассоциировано с повышением риска развития ишемической болезни сердца, инсульта и заболеваний периферических артерий, а также с сосудистой и несосудистой смертностью. Выявлена положительная корреляция между уровнем фибриногена и выраженностью сосудистого поражения белого вещества головного мозга (лейкоареозом) [23]. Фибриноген является одним из основных детерминантов вязкости плазмы. Таким образом, более высокий уровень фибриногена у пациентов может усугублять цереброваскулярную дисфункцию через гемореологические нарушения, индуцируя состояние гиперкоагуляции. Однако, как и в случае с другими маркерами гемостаза (и воспаления), дополнительная прогностическая ценность фибриногена невелика.

Продолжающиеся исследования активационных маркеров свертывания крови (например, Д-димер фибрина), могут обеспечить дополнительную прогностическую ценность для атеротромботических событий. Однако в настоящее время нет достаточной доказательной базы для их рутинного применения при прогнозировании [24].

Фактор VIII относится к неферментативным факторам свертывания, одновременно является белком острой фазы воспаления, т.е. его концентрация растет при любом воспалительном процессе. Фактор VIII легко разрушают ферменты плазмы, поэтому в кровяном русле он циркулирует с фактором Виллебранда. При контакте с отрицательно заряженной поверхностью фосфолипидов (при нарушении целостности эндотелия) фактор VIII высвобождается от переносчика и под влиянием тромбина переходит в активную форму. Активность фактора определяется в модифицированном тесте АЧТВ. Плазма пациента разводится и добавляется плазма, дефицитная по фактору VIII, время свертывания становится удлиненным, коррекция времени АЧТВ пропорциональна концентрации фактора в плазме.

Фактор фон Виллебранда (vWF). В последние годы все большее внимание уделяется патогенной роли vWF в развитии ишемического инсульта и цереброваскулярных заболеваний. vWF-это мультимерный гликопротеин плазмы, который рекрутирует тромбоциты в местах повреждения сосудов и тем самым способствует тромбозу и гемостазу. Рекрутируя лейкоциты, vWF также способствует воспалению, создавая тромбо-воспалительную среду. Увеличивается количество клинических данных, демонстрирующих четкую ассоциацию между высоким уровнем vWF и цереброваскулярными заболеваниями.

PAI-1 (ингибитор активации плазминогена I типа) является прокоагулянтной, провоспалительной и профибротической молекулой. PAI-1 часто экспрессируется в поврежденных тканях, включая миокард и головной мозг, и соотношение PAI-1/активатор плазминогена ткани (tPA) указывает на фибринолитический баланс пациента, который может свидетельствовать о риске тромбоза. PAI-1 инактивирует действие активаторов плазминогена. Повышенный уровень PAI-1 отмечается при тромбозах, раке, болезнях печени, при инфаркте миокарда и ССЗ.

Плазминоген – неактивный предшественник плазмина, основного компонента фибринолитической системы. Снижение уровня плазминогена ассоциировано с возникновением венозных тромбозов. Плазма пациентов, содержащая плазминоген, инкубируется со стрептокиназным реагентом в присутствии фибриногена. Избыток стрептокиназы активирует плазминоген. Комплекс активного плазминегена со стрептокиназой расщепляет субстрат, высвобождая паранитроанилин. Поглощение света прямо пропорционально уровню плазминогена в тестируемом образце.

Альфа-2-антиплазмин. Ингибитор плазмина (альфа-2-антиплазмин) – главный быстродействующий ингибитор фибринолитической системы. В физиологических условиях быстро инактивирует плазмин, образуя неактивные комплексы, имеет высокое сродство к плазмину, взаимодействует с ним, удаляя свободный плазмин из системы циркуляции. Плазма пациента, содержащая ингибитор плазмина, инкубируется с реагентом плазмина в присутствии метиламина. Остаточная активность плазмина измеряется по расщеплению хромогенного субстрата с высвобождением паранитроанилина. Поглощение света обратно пропорционально уровню ингибитора плазмина в тестируемом образце.

XII-а зависимый фибринолиз. Тест XII-а зависимый фибринолиз является базовым методом и предназначен для исследования системы фибринолиза, позволяющим оценить состояние внутреннего и внешнего механизмов активации плазминогена, образования плазмина и лизиса фибринового сгустка. Тест основан на измерении полного лизиса эуглобулиновой фракции, полученной из плазмы крови при осаждении в кислой среде и содержащей факторы свертывания и фибринолиза. Из плазмы выделяют эуглобулиновую фракцию, содержащую плазминоген, фибриноген, факторы свертывания и не содержащую ингибиторов фибринолиза. При добавлении к этой фракции хлористого кальция образуется сгусток фибрина, который затем лизируется плазмином. Реакция активируется фактором XII-а. Время от момента образования сгустка до его растворения выражает фибринолитическую активность исследуемой плазмы крови.

Тромбодинамика. Интегральный потенциал свертывающей системы крови оценивают с помощью глобальных тестов гемостаза, одним из которых является метод тромбодинамики. Тромбодинамика – метод качественной и количественной оценки коагуляционного состояния образца плазмы путем регистрации и анализа пространственно-временной динамики роста фибринового сгустка в гетерогенной in vitro системе без перемешивания. В основе метода лежит представление о том, что в живом организме свертывание происходит локально, в месте повреждения эндотелия кровеносного сосуда или на поверхности клеток, несущих молекулы тканевого фактора.

Тест реализуется с помощью лабораторно диагностической системы «Регистратор тромбодинамики». Предварительно подготовленные образцы плазмы крови помещаются в каналы специальной измерительной кюветы, в которую вводится вставка-активатор с нанесенным покрытием, содержащим тканевой фактор, это имитирует место повреждения стенки кровеносного сосуда. Как только плазма соприкасается с тканевым фактором, запускается процесс свертывания, и от торца вставки-активатора начинается рост фибринового сгустка. Процесс возникновения и роста сгустка регистрируется прибором в режиме последовательной фотосъемки при помощи метода темного поля в течение 30 минут. Полученная серия фотоизображений показывает, как меняются размеры, форма и плотность фибринового сгустка во времени. Кроме роста основного сгустка от вставки–активатора может регистрироваться динамика спонтанного свертывания в объеме плазмы крови, не контактирующем с активирующей поверхностью вставки (Рис. 1).

Рис. 1. Тромбодинамика – метод качественной и количественной оценки коагуляционного состояния образца плазмы.

Основными параметрами тромбодинамики являются:

Tlag (мин) – время задержки начала образования сгустка после контакта плазмы со вставкой-активатором. Характеризует фазу инициации свертывания. Параметр чувствителен к состоянию факторов внешнего пути свертывания.

V (мкм/мин) - скорость роста сгустка – средняя скорость роста сгустка, рассчитанная на интервале 15-25 минут после начала роста. Если из-за интенсивного образования спонтанных сгустков параметр не может быть рассчитан в указанном интервале, то он рассчитывается на 5 минутном интервале, предшествующим началу образования спонтанных сгустков.

Характеризует фазу распространения свертывания. Чувствителен к состоянию внутреннего пути свертывания, к концентрации факторов VIII, IX, XI, V, X, тромбина. Чувствителен к концентрации микровезикул.

Tsp (мин) - время появления спонтанных сгустков в объеме плазмы, изначально не контактирующем со вставкой-активатором. Характеризует собственный прокоагулянтный потенциал плазмы.

Дополнительные параметры тромбодинамики:

Vi (мкм/мин) - начальная скорость роста сгустка – средняя скорость роста сгустка, рассчитанная на интервале 2-6 минут после начала роста сгустка. Характеризует фазу инициации свертывания. Параметр чувствителен к состоянию внешнего и внутреннего пути свертывания.

Vst (мкм/мин) - стационарная скорость роста сгустка – средняя скорость роста сгустка, рассчитанная на интервале 15-25 минут после начала роста сгустка. В случае отсутствия спонтанных сгустков совпадает со скоростью V. При интенсивном образовании спонтанных сгустков не рассчитывается. Характеризует фазу распространения свертывания. Чувствителен к состоянию внутреннего пути свертывания, к концентрации факторов VIII, IX, XI, V, X, тромбина. Чувствителен к концентрации микровезикул.