3. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГИПЕРКОАГУЛЯЦИОННЫХ НАРУШЕНИЙ

Фактор фон Виллебранда (vWF). В последние годы все большее внимание уделяется патогенной роли vWF в развитии ишемического инсульта и цереброваскулярных заболеваний. vWF-это мультимерный гликопротеин плазмы, который рекрутирует тромбоциты в местах повреждения сосудов и тем самым способствует тромбозу и гемостазу. Рекрутируя лейкоциты, vWF также способствует воспалению, создавая тромбо-воспалительную среду. Увеличивается количество клинических данных, демонстрирующих четкую ассоциацию между высоким уровнем vWF и цереброваскулярными заболеваниями.

PAI-1 (ингибитор активации плазминогена I типа) является прокоагулянтной, провоспалительной и профибротической молекулой. PAI-1 часто экспрессируется в поврежденных тканях, включая миокард и головной мозг, и соотношение PAI-1/активатор плазминогена ткани (tPA) указывает на фибринолитический баланс пациента, который может свидетельствовать о риске тромбоза. PAI-1 инактивирует действие активаторов плазминогена. Повышенный уровень PAI-1 отмечается при тромбозах, раке, болезнях печени, при инфаркте миокарда и ССЗ.

Плазминоген – неактивный предшественник плазмина, основного компонента фибринолитической системы. Снижение уровня плазминогена ассоциировано с возникновением венозных тромбозов. Плазма пациентов, содержащая плазминоген, инкубируется со стрептокиназным реагентом в присутствии фибриногена. Избыток стрептокиназы активирует плазминоген. Комплекс активного плазминегена со стрептокиназой расщепляет субстрат, высвобождая паранитроанилин. Поглощение света прямо пропорционально уровню плазминогена в тестируемом образце.

Альфа-2-антиплазмин. Ингибитор плазмина (альфа-2-антиплазмин) – главный быстродействующий ингибитор фибринолитической системы. В физиологических условиях быстро инактивирует плазмин, образуя неактивные комплексы, имеет высокое сродство к плазмину, взаимодействует с ним, удаляя свободный плазмин из системы циркуляции. Плазма пациента, содержащая ингибитор плазмина, инкубируется с реагентом плазмина в присутствии метиламина. Остаточная активность плазмина измеряется по расщеплению хромогенного субстрата с высвобождением паранитроанилина. Поглощение света обратно пропорционально уровню ингибитора плазмина в тестируемом образце.

XII-а зависимый фибринолиз. Тест XII-а зависимый фибринолиз является базовым методом и предназначен для исследования системы фибринолиза, позволяющим оценить состояние внутреннего и внешнего механизмов активации плазминогена, образования плазмина и лизиса фибринового сгустка. Тест основан на измерении полного лизиса эуглобулиновой фракции, полученной из плазмы крови при осаждении в кислой среде и содержащей факторы свертывания и фибринолиза. Из плазмы выделяют эуглобулиновую фракцию, содержащую плазминоген, фибриноген, факторы свертывания и не содержащую ингибиторов фибринолиза. При добавлении к этой фракции хлористого кальция образуется сгусток фибрина, который затем лизируется плазмином. Реакция активируется фактором XII-а. Время от момента образования сгустка до его растворения выражает фибринолитическую активность исследуемой плазмы крови.

Тромбодинамика. Интегральный потенциал свертывающей системы крови оценивают с помощью глобальных тестов гемостаза, одним из которых является метод тромбодинамики. Тромбодинамика – метод качественной и количественной оценки коагуляционного состояния образца плазмы путем регистрации и анализа пространственно-временной динамики роста фибринового сгустка в гетерогенной in vitro системе без перемешивания. В основе метода лежит представление о том, что в живом организме свертывание происходит локально, в месте повреждения эндотелия кровеносного сосуда или на поверхности клеток, несущих молекулы тканевого фактора.

Тест реализуется с помощью лабораторно диагностической системы «Регистратор тромбодинамики». Предварительно подготовленные образцы плазмы крови помещаются в каналы специальной измерительной кюветы, в которую вводится вставка-активатор с нанесенным покрытием, содержащим тканевой фактор, это имитирует место повреждения стенки кровеносного сосуда. Как только плазма соприкасается с тканевым фактором, запускается процесс свертывания, и от торца вставки-активатора начинается рост фибринового сгустка. Процесс возникновения и роста сгустка регистрируется прибором в режиме последовательной фотосъемки при помощи метода темного поля в течение 30 минут. Полученная серия фотоизображений показывает, как меняются размеры, форма и плотность фибринового сгустка во времени. Кроме роста основного сгустка от вставки–активатора может регистрироваться динамика спонтанного свертывания в объеме плазмы крови, не контактирующем с активирующей поверхностью вставки (Рис. 1).

Рис. 1. Тромбодинамика – метод качественной и количественной оценки коагуляционного состояния образца плазмы.

Основными параметрами тромбодинамики являются:

Tlag (мин) – время задержки начала образования сгустка после контакта плазмы со вставкой-активатором. Характеризует фазу инициации свертывания. Параметр чувствителен к состоянию факторов внешнего пути свертывания.

V (мкм/мин) - скорость роста сгустка – средняя скорость роста сгустка, рассчитанная на интервале 15-25 минут после начала роста. Если из-за интенсивного образования спонтанных сгустков параметр не может быть рассчитан в указанном интервале, то он рассчитывается на 5 минутном интервале, предшествующим началу образования спонтанных сгустков.

Характеризует фазу распространения свертывания. Чувствителен к состоянию внутреннего пути свертывания, к концентрации факторов VIII, IX, XI, V, X, тромбина. Чувствителен к концентрации микровезикул.

Tsp (мин) - время появления спонтанных сгустков в объеме плазмы, изначально не контактирующем со вставкой-активатором. Характеризует собственный прокоагулянтный потенциал плазмы.

Дополнительные параметры тромбодинамики:

Vi (мкм/мин) - начальная скорость роста сгустка – средняя скорость роста сгустка, рассчитанная на интервале 2-6 минут после начала роста сгустка. Характеризует фазу инициации свертывания. Параметр чувствителен к состоянию внешнего и внутреннего пути свертывания.

Vst (мкм/мин) - стационарная скорость роста сгустка – средняя скорость роста сгустка, рассчитанная на интервале 15-25 минут после начала роста сгустка. В случае отсутствия спонтанных сгустков совпадает со скоростью V. При интенсивном образовании спонтанных сгустков не рассчитывается. Характеризует фазу распространения свертывания. Чувствителен к состоянию внутреннего пути свертывания, к концентрации факторов VIII, IX, XI, V, X, тромбина. Чувствителен к концентрации микровезикул.

CS (мкм) - размер фибринового сгустка через 30 минут после контакта плазмы со вставкой-активатором. Интегральная характеристика работы плазменного звена свертывания.

D (усл.ед.) - плотность сгустка. Оптический показатель, равный интенсивности рассеяния света фибриновым сгустком, пропорционален плотности фибриновой сети. Характеризует плотность образовавшегося фибринового сгустка и его структуру. Зависит от концентрации фибриногена в совокупности с активностью фактора XIII.

В результате исследования, сопоставление полученных результатов с референтными показателями позволяет дифференцировать состояния гипокоагуляции и гиперкоагуляции (Рис.2).

Рис. 2. Диагностика состояния плазменного гемостаза в тесте «Тромбодинамика».

В процессе формирования гемостатической пробки активизируются механизмы, направленные на ограничение роста сгустка, постепенное растворении тромба и создание условий для нормального кровообращения. Осуществляется эта функция благодаря системе фибринолиза, которая, также как и система свертывания, является многокомпонентной протеолитической системой, в состав которой входят активаторы, ингибиторы и конечный фермент.

Микровезикулы (МВ). Клетки могут выделять различные типы мембранных везикул, включая экзосомы, микровезикулы, и микрочастицы; они все вместе называются экстрацеллюлярными микровезикулами (МВ). МВ заключены в липидный бислой и содержат различные макромолекулярные компоненты, включая РНК, функционально активные белки, последовательности ДНК, липиды и полисахариды.

Хотя МВ впервые были описаны, как «клеточные обломки», которые, как полагали, не имеют биологического значения, недавние исследования подтвердили, что МВ эндотелиального и другого происхождения являются биологическими эффекторами воспаления, повреждения сосудов, ангиогенеза и тромбоза [25, 26, 27]. От 70 до 90 % всех циркулирующих МВ в периферической крови здоровых лиц происходят из тромбоцитов. Отмечены подъемы всех видов МВ при многих сосудистых заболеваниях. В частности, эндотелий-производные МВ представляют собой относительно небольшое (5-15 %), но очень важное подмножество всех циркулирующих микрочастиц. Новые представления об эндотелиальной дисфункции и изменениях в ангиогенезе появляются в результате изучения сосудистых МВ, особенно эндотелиальных МВ.

Адаптивный ответ на гипоксический стресс в значительной степени зависит от межклеточной коммуникации, в которую вовлечены МВ. Авторы недавних исследований сообщают о повышении уровня циркулирующих МВ у пациентов с нарушениями, связанными с гипоксией, такими как инфаркт миокарда и инсульт, что указывает на роль МВ в качестве биомаркеров при этих патофизиологических состояниях.

Связь между состоянием гиперкоагуляции и цереброваскулярными событиями подтолкнула к исследованиям тромбогенных, происходящих из тромбоцитов МВ (ТМВ), которые вовлечены в основную патологию и как прогностические биомаркеры тромбоза.

Следует продолжить изучение использования МВ в качестве биомаркеров, поскольку было установлено, что их повышенный уровень в системном кровотоке коррелирует с клиническим исходом при ряде патологических состояний, связанных с гипоксией.