4. Методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП

4.1.2. Приготовление питательных сред для определения чувствительности

Для оценки чувствительности используют специально предназначенные для этой цели среды, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке и по своим характеристикам удовлетворяющие требованиям, приведенным в разделе 5. Внутрилабораторный контроль качества среды проводят при использовании всех сред, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

Вид питательной среды для оценки чувствительности определяется выбранным методом проведения исследования (агар или бульон), а также тестируемым микроорганизмом.

Выбранная питательная среда для определения чувствительности готовится из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду сразу же разливают в стерильные пробирки или в чашки Петри, или (если необходимо) колбы со средой помещают на водяную баню при 48–50° С, где выдерживают до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят термолабильные питательные добавки и/или рабочие растворы антибиотиков, а затем разливают в пробирки или в чашки Петри.

Агар разливается по чашкам Петри слоем толщиной 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм – 20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при 4–8° С в течение 5 сут.

4.1.3. Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма)

Общим и принципиально важным для всех методов тестирования является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма, ее концентрация должна составлять 1,5×10⁸ КОЕ/мл. Практически наиболее приемлемым методом оценки концентарации бактериальной суспензии является измерение ее оптической плотности. Оптическая плотность бактериальной суспензии с концентрацией 1,5×10⁸ КОЕ/мл при визуальном контроле соответствует стандарту мутности 0,5 по МакФарланду. Контроль оптической плотности суспензии может также осуществляться спектрофотометрически (денситометрически). Существуют коммерчески доступные стандарты мутности и спектрофотометры. Бактериальную суспензию можно готовить либо из бульонной, либо из агаровой культуры.

Приготовление инокулюма из агаровой культуры

Для приготовления инокулюма используют чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначительное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия (физраствора) или питательным бульоном, доводя плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту МакФарланда. Инокулюм следует использовать в течение 15 мин после приготовления.

Приготовление инокулюма из бульонной культуры

При определении чувствительности быстро растущих бактерий с обычными питательными потребностями для приготовления инокулюма также можно использовать 5–6-часовую бульонную культуру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в пробирку с 4,0–5,0 мл жидкой неселективной питательной среды. Инкубируют при 35° С. Через 5–6 ч инкубации плотность микробной суспензии приблизительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0,5 по МакФарланду путем добавления стерильного бульона или физраствора.

Стандарт МакФарланда может быть либо приобретен, либо приготовлен в лаборатории.