Регламент бактериологического исследования последа
Изучив микробный состав различных частей последа (150 образцов), нами были выявлены существенные отличия в количественном и качественном составе микрофлоры его внутренней и наружной части. Так, число микроорганизмов в оболочке в 1,53 раза превысило число штаммов, выделенных из внутренней плацентарной ткани. Достоверные отличия (p<0,05) в видовом составе микрофлоры были выявлены по Enterobacteriaceae sp. (14,0±2,8% против 28,7±3,7%), Streptococcus spp. (2,7±1,3% против 8,0±2,2%), Staphylococcus spp. (19,3±3,2% против 34,0±3,9%) и Corynebacterium spp. (5,3±1,8% против12,0±2,7%).
Особо отметим, что количество бактериальных изолятов с измененными биологическими свойствами, включая штаммы, продуцирующие β-лактамазы преобладали в тканях наружной части с оболочками (40,0±3,6%) относительно внутренней ткани (27,3±36,%).
Таким образом, при осуществлении бактериологического исследования последа, направленного на выделение и идентификацию микроорганизмов, рекомендуем следующий регламент исследований.
1-й день исследования
Забор образцов последа родильниц проводят на родовом столе сразу после его рождения. Стерильными инструментами от органа с краевой части вместе с оболочками отсекают один-два куска (5–7 см). Предпочтение отдают тем участкам, которые имеют выраженные визуальные дефекты (отек, участки некроза, изменение цвета и т.д.). Образцы последа помещают в стерильную емкость. При невозможности доставки проб в лабораторию (вечерние или ночные роды) их оставляют в холодильнике при температуре 6–8º С до утра, учитывая, что плацентарная ткань сама является хорошей питательной средой для микроорганизмов.
Первичный посев образцов проводят на плотные питательные среды (кровяной агар, желточно-солевой агар, среда Сабуро, агар Эндо) методом мазков-отпечатков и полужидкие (жидкие) среды обогащения (молочно-ростовой бульон, среда Блоурокка, СКС-199, МРС-2) методом глубинного погружения. Таким образом, микробиологическое исследование последа проводят количественным (на плотные среды для первичного посева) и качественным методом (на среды обогащения) на основные возбудители гнойно-септических инфекций и нормофлору мочеполового тракта женщины. Все пробы инкубируют в стандартном режиме (при температуре 37º С) в течение 18–24 часов.
2–3-й день исследования
После суточной инкубации проводят просмотр биологического материала, осуществляют фиксацию промежуточных результатов в журнале с указанием характера роста выросших колоний, оценку тинкториальных и морфологических свойств бактериальных изолятов, постановку ориентировочных дифференцирующих тестов по определению их родовой принадлежности.
Из полужидких сред обогащения делают дополнительные высевы на среды для первичного выделения (5%-ный кровяной агар, ЖСА, агар Эндо и пр.) и проводят микроскопию для визуализации и сопоставления результатов роста в жидких и на плотных питательных средах.
4-й день исследования
Видовую идентификацию аэробных, факультативно-анаэробных, анаэробных штаммов микроорганизмов и грибов рода Candida spp. осуществляют по расширенной микробиологической схеме, включая в набор тестов основные и дополнительные культуральные и биохимические признаки [4, 8, 9].
У энтеробактерий и неферментирующих грамотрицательных бактерий определяют адгезивную активность, капсулообразование, повышенный уровень слизеобразования, отсутствие разложения лактозы у лактозопозитивных видов, гемолитические свойства, ДНК-азную активность, протеолитические свойства, интенсивность дыхания и др. Адгезивную активность учитывают на культурах клеток HEp-2 и Hela, в тестах с эритроцитами человека или по образованию пристеночного кольца на мясопептонном бульоне. Капсулообразование изучают с помощью окраски по методу Бурри-Гинса, повышенный уровень слизеобразования – визуально на чашках нативного роста микробной культуры, отсутствие подвижности у подвижных в норме форм – на 0,4%-ном полужидком агаре, отсутствие разложения лактозы у лактозопозитивных видов – на агаре Эндо, Левина, Плоскирева. Выявление тиолзависимого гемолизина проводят посевом культуры на питательную среду для его выработки, α-гемолитическую активность – уколом суточной агаровой культуры в 2%-ный агар Хоттингера с 5%-ной суспензией эритроцитов кролика. Определение ДНК-азной активности, протеолитических ферментов (среда с молоком и лакмусом, с молоком и метиленовой синью, с желатиной), интенсивности дыхания проводят с красителем Конго-рот.
У стафилококков изучают выработку ферментов плазмокоагулазы, лецитовителлазы, ДНК-азы, антилизоцимную, антиинтерфероновую, антикомплементарную активность. Энтерококки и коринебактерии тестируют на выработку гемолизинов, проводя визуализацию на 5%-ном кровяном агаре. Наряду с этим у выросших культур определяют антиинтерфероновую, антилизоцимную и антикомплементарную активность.
Изучение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам дискодиффузионным методом проводят по диаметрам зон задержки роста в плотной среде МХА (BioMerieux) с помощью аппарата Densi-La-Meter II «Lachema», диспенсера дисков HiDisc Dispenser Marc III «HiMedia» с антибиотиками производства «HiMedia», не менее чем к 12 препаратам из профильных групп [6]. Интерпретацию результатов проводят путем сравнения диаметра зон тестируемого микроорганизма с критериями, разработанными на основе корреляции – величины диаметров зон подавления роста и величины МПК антибиотика.
Определение продукции β-лактамаз у энтеробактерий и неферментирующих грамотрицательных бактерий осуществляют с использованием методов «двойных дисков», Е-теста и теста Oxoid и ПЦР-диагностики. При определении продукции β-лактамаз грамположительных бактерий применяют нитроцефиновые диски и йодометрический метод на бумажных полосках. Резистентность к оксациллину у стафилококков изучают скрининговым методом (на чашке с 4,0%-ным солевым агаром, содержащим 6 мкг/мл оксациллина), дискодиффузионным методом, с помощью латекс-агглютинации и ПЦР по выявлению пенициллинсвязывающего белка – ПСБ2а. Дополнительно у энтеробактерий и неферментирующих грамотрицательных бактерий для детекции β-лактамаз расширенного спектра методом серийных разведений с определением МПК можно использовать комбинацию цефтазидим/клавуланат (снижение величины МПК в сравнении с изолированным цефтазидимом более чем в 4 раза) при постоянной концентрации клавуланата 4,0 мкг/мл.