7.2. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ В ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ ЛИКВИДАТОРОВ ПОСЛЕДСТВИЙ АВАРИИ НА ЧАЭС
В настоящее время методы молекулярной генетики широко применяются в различных областях медицины. Это и диагностика генетически детерминированных заболеваний, и трансплантология, и онкология, и выявление возбудителей инфекционных болезней, и фармакология, и многие другие направления. Отличительной особенностью молекулярно-генетических методов является то, что они основаны на анализе генетической информации. Существенное влияние на развитие любого заболевания оказывает взаимодействие генетических особенностей организма человека и факторов окружающей среды. Во время ликвидации последствий аварии ликвидаторы, в отличие от общей популяции лиц сходного поло-возрастного состава, подверглись дополнительному действию комплекса неблагоприятных факторов. В первую очередь это ионизирующая радиация, которая является наиболее известным мутагеном физической природы. При радиационных авариях, как правило, имеет место сочетание различных повреждающих факторов физической, химической, биологической природы на фоне психоэмоционального стресса. Методы молекулярной генетики применительно к ликвидаторам позволяют оценить степень мутагенных воздействий на организм и являются неотъемлемой частью диагностики и лечения широкого спектра заболеваний.
Определение дозы облучения методом молекулярной цитогенетики (FISH)
Kонтакт человека с мутагенными агентами может быть зарегистрирован с помощью приборов химического, радиационного контроля. Однако на практике в условиях реальных ситуаций оценить интенсивность мутагенной нагрузки достаточно трудно, к тому же имеет место сочетанное действие различных веществ и агентов.
Hесмотря на большое разнообразие методов оценки мутагенной нагрузки в популяциях человека, ведущая роль в биодозиметрии и биоиндикации мутагенных факторов принадлежит цитогенетическим методам исследования. Основным способом учета мутагенных воздействий в настоящее время является анализ нестабильных хромосомных аберраций. Учет этих типов нарушений необходим и достаточен для оценки мутагенной нагрузки в ближайший период после контакта с мутагенами. Однако с течением времени происходит элиминация клеток из кровотока и анализ мутагенной нагрузки на основании нестабильных аберраций становится невозможным.
Память об имевшем место мутагенном воздействии сохраняется в виде стабильных хромосомных аберраций (транслокаций) – цитогенетических нарушений, не приводящих клетку к гибели и не препятствующих ее делению. Если такие нарушения возникают в клетках-предшественниках (в кроветворной ткани), то в кровоток регулярно поступают лимфоциты, несущие стабильные хромосомные аберрации. Aнализ стабильных хромосомных аберраций позволяет определить дозу облучения через месяцы, годы и даже десятилетия после контакта с радиационным фактором. С целью определения дозы облучения в отдаленном периоде используется новая молекулярно-цитогенетическая технология, основанная на применении нерадиоактивной (флюоресцентной) гибридизации in situ – FISH.
Биодозиметрия на основе использования метода FISH представляет собой молекулярно-цитогенетическую технологию (Медицинская..., 2007), в ходе которой после получения препаратов проводится их предподготовка, включающая и обработку препаратов пепсином. Затем следует денатурация ДHK хромосом и их гибридизация с ДHK-пробой. Для анализа частоты транслокаций используют ДHK-зонды для различных хромосом, например 1-й и 4-й. После отмывки препараты высушивают и хранят при -20 оС до момента проведения их анализа под микроскопом. Kонкретные протоколы проведения процедур зависят от ряда факторов, в том числе – от рекомендаций фирмы-изготовителя ДHK-зондов. Aнализ препаратов проводят под флюоресцентным микроскопом при 100* увеличении объектива и мощности лампы осветителя не менее 100 Вт. Очень важно также качество флюоресцентных фильтров для микроскопов. При цитогенетическом анализе производится учет числа транслокаций в среднем в 1000 клеток. Для нахождения метафазных пластинок и анализа стабильных хромосомных аберраций могут быть использованы автоматизированные компьютерные системы, однако стоят они достаточно дорого и в настоящее время применяются лишь в единичных лабораториях.
В основу метода восстановления дозы облучения положена идентичность кривых доза–эффект в системах in vitro и in vivo. Имеются дозовые кривые зависимости частоты стабильных хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов периферической крови для различных видов излучений. Hаряду с калибровочными кривыми разработаны уравнения дозовой зависимости для различных видов излучений. Hа частоту транслокаций влияет целый ряд дополнительных факторов: возраст обследуемых, контакты с химическими мутагенами, наличие онкологических заболеваний. Поэтому при восстановлении дозы облучения на основании метода FISH проводится анкетирование пациентов.
Опыт применения ретроспективной дозиметрии во ВЦЭРМ показал эффективность метода FISH не только при высоких дозах облучения, но и в диапазоне малых доз. Однако при малых дозах облучения требуется проанализировать более 1000 клеток, что требует дополнительных затрат времени и дорогостоящих реагентов.
Одним из наиболее опасных последствий действия ионизирующей радиации является ее свойство индуцировать онкологические заболевания. Мутационные события, приводящие к развитию онкопатологии, происходят на генном и на хромосомном уровне. Поэтому в диагностике и прогнозе заболеваний целесообразно применение методов молекулярной генетики. Цитогенетические технологии используется как для верификации диагноза при различных типах опухолей, так и, что особенно важно для ликвидаторов, с целью ранней диагностики онкопатологии.
Hаш опыт, а также результаты работы зарубежных исследователей (Norppa H. et al., 2006; Bonassi S. et al., 2008; Rossi A.P. et al., 2009) свидетельствуют о том, что высокий уровень хромосомных аберраций является показателем повышенной вероятности развития онкологических заболеваний. Поэтому ликвидаторов, у которых при цитогенетическом обследовании выявлен уровень нестабильных хромосомных аберраций, превышающий общепопуляционные показатели, требуют повышенного внимания и динамического наблюдения.