Скрининг не предполагает проведения специального исследования, его основу должен составлять анализ данных, получаемых в рутинной практике. В то же время для эффективного скрининга в рутинное микробиологическое исследование необходимо включать несколько цефалоспориновых антибиотиков, даже если использование некоторых из них в качестве терапевтических препаратов не планируется. Наиболее чувствительными к гидролизу БЛРС считаются цефподоксим и цефтазидим. Соответственно эти препараты целесообразно включать в набор для определения чувствительности Enterobacteriaceae. При отсутствии возможности тестирования цефподоксима минимальный набор цефалоспоринов III поколения, используемых для определения чувствительности грамотрицательных микроорганизмов, должен включать цефотаксим, цефтриаксон и цефтазидим.
Чем больше цефалоспоринов использовано для тестирования, тем более достоверными будут результаты выявления БЛРС. Некоторые штаммы могут проявлять высокий уровень устойчивости ко всем АБП, у других же обнаруживается лишь незначительное повышение МПК к 1–2 АБП цефалоспоринового ряда. Результаты тестирования Klebsiella spp. и E. coli к цефалоспоринам, указывающие на возможную продукцию БЛРС этими штаммами, приведены в табл. 10.
После выявления штамма, подозрительного на продукцию БЛРС, рекомендуется провести подтверждающий тест.
Тесты, подтверждающие продукцию БЛРС. Все фенотипические тесты для подтверждения продукции БЛРС являются вариантами стандартных методов определения чувствительности к АБП и основаны на ингибиции БЛРС клавуланатом. При постановке этих тестов проводится сравнение чувствительности исследуемых микроорганизмов к различным цефалоспоринам III поколения и к комбинации этих антибиотиков с клавулановой кислотой.
Диско-диффузионный метод предусматривает использование стандартных дисков с обычным содержанием цефотаксима и цефтазидима (30 мкг) или диска с цефподоксимом (10 мкг), а также дисков, содержащих комбинации: цефотаксим + клавуланат, цефтазидим + клавуланат (30/10 мкг) или цефподоксим + клавуланат (10/10 мкг). В исследование целесообразно включать одновременно и диски с цефотаксимом, и диски с цефтазидимом и их комбинациями с клавуланатом.
Постановка теста. Методика приготовления микробной взвеси и инокуляции чашек с агаром стандартные. На поверхность агара накладывают диски с цефалоспоринами и их комбинациями с клавулановой кислотой. Чашки инкубируют в термостате при 35° С в течение 18–20 ч.
Интерпретация результатов. Различие в диаметрах зон подавления роста для дисков с цефподоксимом/клавулановой кислотой и цефподоксимом на 6 мм и более, для дисков с цефотаксимом/клавулановой кислотой и цефотаксимом, цефтазидимом/клавулановой кислотой и цефтазидимом – на 5 мм и более свидетельствует о продукции штаммом БЛРС. Необходимо подчеркнуть, что результат считается положительным, если указанные различия получены хотя бы для одной пары дисков. Контроль качества. Для контроля качества исследования необходимо использовать 2 штамма (отрицательный и положительный контроли):
- отрицательный контроль: при тестировании контрольного штамма E. coli, не продуцирующего β-лактамаз, различия в диаметрах зон между дисками с ингибитором и без него не должны превышать 2,0 мм;
- положительный контроль: при тестировании контрольного штамма K. pneumoniae, продуцирующего БЛРС, различия в диаметрах зон между дисками с цефподоксимом/клавулановой кислотой и цефподоксимом ≥6 мм, с цефотаксимом/клавулановой кислотой и цефотаксимом >3 мм, с цефтазидимом/клавулановой кислотой и цефтазидимом ≥5 мм. Метод серийных разведений в бульоне предполагает использование двойных серийных разведений препаратов в следующих диапазонах концентраций: цефтазидима – от 0,25 до 128,0 мг/л, цефтазидима/клавуланата – от 0,25/4,0 до 128,0/4,0 мг/л; цефотаксима от 0,25 до 64,0 мг/л; цефотаксима/клавуланата – от 0,25/4,0 до 64,0/4,0 мг/л. В исследование целесообразно включать оба цефалоспорина и их комбинации с клавулановой кислотой. Постановка теста. Методика выполнения исследования (приготовление разведений антибиотиков в бульоне, микробной взвеси, инокуляция и инкубация) – стандартная.
Интерпретация результатов. Снижение МПК цефтазидима или цефотаксима не менее чем в 8 раз (на 3 последовательных двукратных разведения) в присутствии ингибитора, в сравнении со значениями МПК соответствующих цефалоспоринов без ингибиторов, свидетельствует о продукции штаммом БЛРС.
Контроль качества:
- Отрицательный контроль: при тестировании контрольного штамма E. coli, не продуцирующего β-лактамаз, соотношения МПК соответствующих цефалоспоринов III поколения к МПК их комбинации с клавуланатом должны быть <8;
- положительный контроль: для штамма K. pneumoniae, продуцирующего БЛРС, соотношения значений МПК цефалоспоринов и МПК их комбинаций с клавуланатом должны быть ≥8.
Метод двойных дисков. Хотя этот метод и не относится к хорошо стандартизованным, его чувствительность, специфичность и простота выполнения позволяют рассматривать приемлемым методом для рутинной практики. Метод предполагает использование доступных коммерческих дисков с цефалоспоринами III поколения и с амоксициллином/клавуланатом.
Метод «двойных дисков» представляет собой вариант классического ДДМ определения чувствительности, который позволяет выявить продукцию БЛРС по наличию расширенной зоны подавления роста вокруг диска с каким-либо цефалоспорином III поколения напротив диска, содержащего клавулановую кислоту (синергизм отмечается в участке пересечения зон диффузии двух дисков, расположенных на небольшом расстоянии друг от друга).
Постановка теста. Методика приготовления микробной взвеси, инокуляции и инкубации чашек не имеет отличий от стандартного ДДМ. Особенностью метода является то, что через 5–10 мин после инокуляции на поверхность агара накладывают диски с АБП: в центр – диск, содержащий клавулановую кислоту, обычно в виде комбинации амокси «двойных дисков». Отрицательные результаты: a) E.coli (БЛРС-); б) E.cloacae (гиперпродукция AmpC). Положительные результаты: в) и г) – K.pneumoniae (БЛРС+). Обозначения дисков: AMC – амоксициллин/клавулановая кислота (20/10 мкг), CAZ – цефтазидим (30 мкг), CTX – цефотаксим (30 мкг), CPO – цефпиром (30 мкг) циллин/клавуланат (20/10 мкг), по бокам от него на расстоянии 20 и 30 мм между центрами дисков – диски с цефтазидимом (30 мкг) и цефотаксимом (30 мкг). Использование двух дисков каждого АБП, расположенных на разном расстоянии от диска с клавулановой кислотой, позволяет повысить эффективность обнаружения БЛРС.