6. Определение чувствительности отдельных групп бактерий к АБП и интерпретация результатов

6.8. Определение чувствительности Haemophilus influenzae

Питательные среды. Для определения чувствительности Haemophilus spp. используют специальную питательную среду, например HTM, содержащую необходимые для гемофил факторы роста. Эту среду можно приготовить в лаборатории на основе среды Мюллера–Хинтон:

• среду готовят на основе бульона или агара Мюллера–Хинтон. После растворения основы в нее добавляют дрожжевой экстракт (до конечной концентрации 5 мг/мл) и раствор гематина (до конечной концентрации 15 мг/л). Для приготовления основного раствора гематина 50 мг порошка помещают в 100,0 мл 0,01н NaOH (0,01 моль/л) и нагревают при тщательном перемешивании до полного растворения. В подготовленную для автоклавирования среду на 1 л вносят 30,0 мл основного раствора гематина;
• после автоклавирования и охлаждения основы до 48–50° С в нее асептически вносят раствор никотинамидадениндинуклеотида (НАД) до конечной концентрации 15 мг/л. Раствор НАД стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм;
• при определении чувствительности к сульфаниламидам и триметоприму в охлажденную до 48–50 °C среду асептически вносят также раствор тимидинфосфорилазы до конечной концентрации 0,2 ед/мл.

Haemophilus spp. характеризуются природной чувствительностью к большинству распространенных антибиотиков, в том числе и к бета-лактамам. Практически важным исключением является отсутствие активности в отношении Haemophilus spp. у цефалоспоринов I поколения. Наибольшее значение имеет приобретенная резистентность к ампициллину, обусловленная продукцией плазмидных бета-лактамаз ТЕМ-1 и ROB-1. Кроме ампициллина эти ферменты частично гидролизуют цефалоспорины I поколения, но не активны в отношении препаратов II–III поколений.

Известны штаммы H. influenzae, устойчивость которых к ампициллину связана с изменением мишени действия бета-лактамных антибиотиков (пенициллинсвязывающих белков) или снижением проницаемости наружной клеточной мембраны. Эти штаммы получили название бета-лактамазо-негативных ампициллинорезистентных (БЛНАР) и считаются нечувствительными к ингибиторозащищенным пенициллинам и таким цефалоспоринам, как цефаклор, цефуроксим, цефиксим и цефтибутен. До настоящего времени не получено клинических штаммов H.influenzae, устойчивых к цефалоспоринам III–IV поколений и карбапенемам.

Для выявления ампициллинорезистентности у гемофильной палочки в рутинной лабораторной практике достаточно определения чувствительности к ампициллину диско-диффузионным методом и теста на продукцию бета-лактамаз с нитроцефином.

Эти два теста позволяют подразделить штаммы на ампициллиночувствительные, бета-лактамазопродуцирующие ампициллинорезистентные (чувствительные к ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам II–IV поколений) и БЛНАР, которые следует расценивать как резистентные к ингибиторозащищенным пенициллинам и некоторым цефалоспоринам. Причем тестирование с диском, содержащим ингибиторозащищенные пенициллины, например амоксициллин/клавуланат, не позволяет отличить БЛНАР от ампициллиночувствительных штаммов H. influenzae.

Макролидные антибиотики, в целом, отличаются невысоким уровнем активности в отношении Haemophilus spp., при этом между ними выявляются незначительные различия (наибольшая активность характерна для азитромицина). Низкий уровень активности макролидов связан с наличием у этого микроорганизма фоновой активности механизмов активного выведения. Подавляющее большинство штаммов H. influenzae с микробиологической точки зрения относятся к «дикой» популяции, лишенной дополнительных детерминант резистентности к этим АБП. Однако in vivo при приеме в рекомендуемых дозах концентрации макролидов в органах и тканях оказываются недостаточными для обеспечения эрадикации патогена. Учитывая приведенные факты, обоснованность критериев чувствительности H. influenzae к азитромицину и кларитромицину вызывает сомнения.

Устойчивость к фторхинолонам среди H. influenzae встречается редко, однако частота встречаемости штаммов с повышенными значениями для них МПК фторхинолонов возрастает, что обосновывает необходимость тестирования указанных АБП. Наиболее вероятно, что между отдельными представителями этой группы существует перекрестная резистентность, характерная и для других грамотрицательных бактерий.

Примерный перечень АБП, рекомендуемых при определении чувствительности H. influenzae, выделенных из различных локусов организма, представлен в табл. 18.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности H. influenzae (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в табл. 9.

6.9. Определение чувствительности Neisseria gonorrhoeae

Оценка антибиотикочувствительности N. gonorrhoeae представляет собой достаточно сложную методическую проблему. Методы определения чувствительности гонококков в бульоне недостаточно надежны, поэтому следует использовать только метод разведений в агаре или ДДМ.

Питательные среды. Для определения чувствительности N. gonorrhoeae используют гонококковый агар, состоящий из гонококковой агаровой основы и комплексной питательной добавки следующего состава:

глюкоза....................................................... 100 г,

L-цистеингидрохлорид............................. 25,9 г,

L-глютамин................................................ 10 г,

L-цистин..................................................... 1,1 г,

аденин......................................................... 1 г,

никотинамидадениндинуклеотид............ 0,25 г,

витамин В₁₂............................................... 0,1 г,

тиамина пирофосфат................................. 0,1 г,

гуанина гидрохлорид................................ 0,03 г,

Fe(NO₃)3.6H₂O.......................................... 0,02 г,

парааминобензойная кислота................... 0,013 г,

тиамина гидрохлорид................................ 3 г.

При тестировании карбапенемов и клавулановой кислоты необходимо использовать добавку, не содержащую цистеин.

Все ингредиенты растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и затем доводят объём до 1 л. КПД стерилизуют фильтрацией через бактериальный фильтр (0,02 мкм). КПД нельзя хранить и автоклавировать, необходимо использовать ex tempore. Полученную смесь асептически вносят в GC агар после автоклавирования и охлаждения до 48–50 °С в количестве 1,0% (объем/объем). Агар разливают в чашки Петри без добавления антибиотиков для ДДМ и с добавлением АБП для метода разведения в агаре.

Средствами выбора для лечения гонореи являются бета-лактамные антибиотики. Однако среди штаммов N. gonorrhoeae широко распространена резистентность к бензилпенициллину, тетрациклинам и макролидам. В ряде регионов мира отмечают резкое возрастание частоты резистентности гонококков к фторированным хинолонам. Для практики крайне важно то, что до сих пор достоверно не описано случаев резистентности гонококков к цефалоспоринам III поколения, что позволяет рассматривать цефалоспорины III поколения (цефотаксим и цефтриаксон) как препараты выбора для лечения гонореи.

Таким образом, на практике оценивать антибиотикочувствительность гонококков следует только в тех случаях, когда для лечения невозможно или нецелесообразно использовать цефалоспорины III поколения. Такие ситуации складываются при наличии у пациентов аллергии к бета-лактамам или при смешанных гонорейно-хламидийных инфекциях, а также для эпидемиологического мониторинга. В набор для тестирования N. gonorrhoeae рекомендуется включать фторхинолоны (офлоксацин или ципрофлоксацин), тетрациклины, спектиномицин. Дополнительно для более полной характеристики штаммов и эпидемиологического мониторинга целесообразно определять чувствительность к пенициллину и цефалоспоринам II–III поколений. Критерии оценки антибиотикочувствительности Neisseria gonorrhoeae приведены в табл. 10.