2.3 Лабораторные диагностические исследования
Рекомендуется определение содержания метионина в крови всем новорожденным для формирования групп риска по ГЦУ [100,101]. Схема неонатального скрининга приведена в Приложении Б5.
Комментарии: для скринингового исследования направляется тест-бланк с сухими пятнами крови в установленные сроки в специализированную лабораторию неонатального скрининга конкретного региона. Метионин используется как первичный маркер в большинстве программ неонатального скрининга. Данные из ретроспективных когорт показывают, что выявление гиперметионинемии в комбинации с повышенным уровнем гомоцистеина позволяет своевременно диагностировать классическую форму ГЦУ. Однако чувствительность и специфичность метионина, как биомаркера для скрининга, невысока (PPV 5–15%), возможны как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Новорожденным с подозрением на гомоцистинурию, обусловленную недостаточностью цистатионин-β-синтазы (уровень метионина >80 мкмоль/л), должен быть проведен ретест. При положительном результате ретеста необходимо определения уровня общего гомоцистеина (tHcy) в крови. Если концентрация tHcy превышает нормальное значение (>11 мкмоль/л), диагноз гомоцистинурии может быть подтвержден на биохимическом уровне. Следует вызвать семью для проведения медико-генетического консультирования, назначения терапии, осуществляется взятие образцов крови для проведения ДНК-диагностики в референс-центре.
Новорожденным с подозрением на гомоцистинурию, обусловленную недостаточностью метилентетрагидофолатредуктазы (уровень метионина меньше 7 мкмоль/л), должен быть проведен ретест. При положительном результате ретеста необходимо определения уровня общего гомоцистеина (tHcy) в крови. Если концентрация tHcy превышает нормальное значение (>11 мкмоль/л), диагноз гомоцистинурии может быть подтвержден на биохимическом уровне, но требуется дополнительное подтверждение диагносза методами ДНК-анализа.
Рекомендовано пациентам с подозрением на гомоцистинурию количественное определение метионина (Комплексное определение концентрации на аминокислоты и ацилкарнитины в крови методом тандемной масс-спектрометрии), общего и свободного гомоцистеина в крови и моче (Исследование уровня гомоцистеина в крови, Исследование аминокислот и метаболитов в моче/ Комплексное определение содержания органических кислот в моче/Комплекс исследований для диагностики органических ацидурий) для диагностики классической гомоцистинурии и дефицита MTHFR и дифференциальной диагностики с другими формами наследственных заболеваний, сопровождающихся гомоцистинурией [100].
Комментарии: для классической ГЦУ характерны повышение уровня метионина в сыворотке крови и гомоцистеина в сыворотке крови и моче, снижение цистина в сыворотке крови и моче (Приложение А3.5). Важно, что концентрация гомоцистеина в крови (Исследование уровня гомоцистеина в крови) должна быть определена у пациента, не получающего #пиридоксин** (в том числе в составе поливитаминов) минимум в течение двух недель. Имеются данные о необходимости у некоторых пациентов более длительного периода исключения #пиридоксина**: 1-2 месяца.
Для MTHFR характерен высокий уровень гомоцистеина, сниженный или нормальный уровень метионина, нормальный уровень метилмалоновой кислоты. Уровень tHcy обычно составляет> 50, но в большинстве случаев> 100 мкмоль/ л у нелеченых пациентов с расстройствами реметилирования [47–50].
Обычно tHcy измеряют хроматографическими или иммуноферментными методами. Хроматографические методы более специфичны, чем иммуноферментные, и обычно сочетаются с обнаружением тандемной масс-спектрометрии (МС / МС), что позволяет одновременно определять другие соединения, представляющие интерес для диагностики и наблюдения за этими заболеваниями, например Met, цистеин [51] или, возможно, цистатионин [52,53].
Для забора крови на tHcy подходят различные пробирки (ЭДTA, гепаринизировая, цитратная, пробирки для гелевого сепаратора). Однако образцы крови следует центрифугировать в течение 1 часа или хранить в холодном состоянии до центрифугирования (<6 часов). После удаления клеток крови tHcy остается стабильным в течение нескольких недель при +4 ° C и в течение нескольких лет после замораживания [51]. Свободный гомоцистин в плазме или моче, измеренный с помощью традиционной ионообменной хроматографии, может оставаться неопределяемым даже при наличии значительно повышенного tHcy в плазме [54,55]. Также не следует измерять свободный гомоцистеин вместо общего гомоцистеина.
Рекомендовано всем пациентам с высоким уровнем tHcy в крови и моче (подозрение на гомоцистинурию) исследование уровня витамина В12 (цианокобаламина) в крови для дифференциальной диагностики [5,73].
Рекомендовано всем пациентам с клиническими и/или биохимическими признаками классической ГЦУ проведение анализа гена CBS для подтверждения диагноза [56].
Комментарии: подтверждающая диагностика может быть выполнена как с помощью прямого автоматического секвенирования, так и с помощью массового параллельного секвенирования (NGS). Определение мутаций в гене CBS важно для подтверждения диагноза, эффективного медико-генетического консультирования и прогнозирования тяжести течения болезни.
Рекомендовано всем пациентам с клиническими и/или биохимическими признаками дефицита MTHFR проведение анализа гена MTHFR для подтверждения диагноза [9].
Комментарии: генетическое тестирование на дефицит MTFHR следует интерпретировать с осторожностью, поскольку в этом гене существует множество вариантов, которые не связаны с ГЦУ. Так наиболее изученный термолабильный вариант c.677C> T в MTHFR, не ответственен за серьезные нарушения реметилирования, и только в комбинации с тяжелыми патогенными вариантами может приводить к легкой форме ГЦУ.
Рекомендуется всем пациентам, у которых не подтвержден диагноз классической ГЦУ или дефицита MTHFR в случае выявления высокого уровня tHcy в крови исследовать уровень метилмалоновой кислоты в моче, ацилкарнитинов в крови (Комплексное определение концентрации на аминокислоты и ацилкарнитины в крови методом тандемной масс-спектрометрии), (Исследование аминокислот и метаболитов в моче), Исследование уровня витамина В12 (цианокобаламин) в крови перед началом терапии с целью дифференциальной диагностики с другими формами гипергомоцистинемии [9] .
Рекомендовано пациентам с подтвержденной классической ГЦУ и дефицитом MTHFR исследование уровня (витамина B9) фолиевой кислоты в сыворотке крови, а также исследование уровня витамина В12 (цианокобаламин) в крови с целью оценки наличия дефицита и определения показаний к назначению данных витаминов [5,9,57].
Рекомендуется пациентам с классической ГЦУ и дефицита MTHFR проведение Общего (клинического) анализа крови развернутого, анализа крови биохимического общетерапевтического (Исследование уровня мочевины в крови, Исследование уровня креатинина в крови; Исследование уровня альбумина в крови), Исследование уровня ферритина в крови для оценки нутритивного статуса [5,9] .
Комментарии: данных по дефициту различных микронутриентов при классической ГЦУ нет, однако считается, что они могут быть аналогичны пациентам с фенилкетонурией. По результатам проводится коррекция диеты.
Рекомендовано пациентам с классической ГЦУ и дефицита MTHFR определение/исследование уровня общего кальция, ионизированного кальция в крови, исследование уровня неорганического фосфора в крови, общего магния в сыворотке крови, определение активности щелочной фосфатазы в крови, исследование уровня 25-ОН витамина Д в крови, Исследование уровня паратиреоидного гормона в крови с целью оценки метаболизма кальция и контроля остеопении в связи с повышенным риском остеопороза [5,9].
Рекомендовано исследование/определение протромбинового (тромбопластинового) времени в крови или в плазме, определение международного нормализованного отношения (MHO) расчетным методом, активированного частичного тромбопластинового времени, исследование уровня фибриногена в крови, исследование/определение концентрации Д-димера в крови количественное для мониторинга скрининговых показателей гемостаза [58,59].